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蓍草提取物预防慢性肝损伤

来源:| 作者:| 发布时间:2015年08月07日

蓍草提取物预防慢性肝损伤

背景与目的:

研究蓍草提取物对大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的预防作用,并探讨其作用机制。

材料与方法:

采用40% CCl 4皮下注射制备肝纤维化大鼠模型,分别用3种不同浓度的蓍草提取物进行干预,观察检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝组织病理学变化。

结果:

蓍草提取物预防给药能降低CCl 4所致大鼠血清中异常增高的ALT、AST含量,光镜下观察肝纤维化模型组大鼠肝细胞严重变性、坏死,胶原纤维明显增加,蓍草预防各组大鼠肝细胞病理损伤得到明显改善。

结论:蓍草提取物对大鼠实验性肝损伤具有一定程度的预防作用和抗肝纤维化作用。

蓍草为菊科植物Achillea millefolium L.蓍草的地上部分,辛苦、微温,入心、肝、肺三经,具有活血,祛风,止痛,解毒的功效[1]。

在福建大田、永春等地有栽培,用于治疗各型肝炎,疗效显著,是民间常用的保肝治肝的药物。为研究蓍草对大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的预防作用,我们观察了蓍草提取物对CCl 4诱发大鼠实验性慢性肝损伤、肝纤维化的影响。

现报道如下:

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠60只,清洁级,雌雄各半,体重(180±20) g,购自中科院上海实验动物中心,合格证书:医动字第23-016号。

1.2 主要试剂和药品

四氯化碳(CCl4),广东西陇化工厂生产,化学纯。临用前以花生油调和按体积比配成40% CCl 4溶液。蓍草(Achillea millefolium L.Aml)原药材购自闽南永春(农民种植),经福建中医学院中药系专家鉴定为菊科植物蓍草。

药物蓍草按水煎剂制备法得浓缩药液,滤过,滤液中加3倍量95%乙醇,边加边搅拌,使药液含醇量达70%左右,冷藏24 h,过滤,弃含粘液质、糊化淀粉和蛋白质等杂质的沉淀物。醇溶液减压回收乙醇至无醇味,浓缩,冷藏24 h,滤过弃去含脂溶性成分的沉淀,滤液含有机酸、生物碱等成分。

制成蓍草提取物1.2 g/ml(每1 ml溶液含1.2 g生药), 4 ℃冰箱保存待用。用前配制成0.3、0.6、1.2 g/ml的低、中、高3种剂量。

秋水仙碱由云南西双版纳制药厂生产,批准文号:国药准字H53021369。将秋水仙碱片研碎用蒸馏水配成0.02 mg/ml混悬液,用作阳性对照药物。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.3 实验方法

Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重(180±20) g,随机分为6组:空白对照组(8只) ,肝纤维化模型对照组(12只),秋水仙碱阳性对照组(10只),蓍草预防低、中、高剂量组各10只。普食普水饲养1周后参考文献[3]方法开始造模,除空白对照组外其余各组以40% CCl 4花生油溶液腹部皮下注射,首次 5 ml/kg,以后3 ml/kg,每周2次,连续注射8周。

造模前两天开始灌胃给蓍草提取物预防,一直持续到实验结束,每日给药1次,剂量为:空白组和模型组灌以蒸馏水10 ml/(kg·d);秋水仙组灌以秋水仙碱0.2 g/(kg·d);蓍草预防低、中、高剂量组分别灌以蓍草提取物3 、6、 12 g/(kg·d),逐日观察大鼠活动、进食量、毛色等情况。8周末各组大鼠于末次灌胃24 h后取材、处死。实验中有4只大鼠死亡未列入统计。

每只大鼠摘眼球法取血约3 ml,装入预先滴有肝素50 μl的EP管中,以3 000 r/min离心10 min,取上清液,赖氏法测定血清ALT、AST活性。取血完毕后处死大鼠,立刻剖开腹腔,暴露肝脏,取肝右中央叶约0.5 cm3,迅速投入10%福尔马林溶液中固定。

石蜡包埋,制备病理切片,HE染色,光学显微镜观察肝组织病理变化。肝组织病理学改变分为4级:正常肝组织为“-”;肝小叶结构完整,肝细胞点状坏死,炎细胞浸润,散在的肝细胞脂肪变性为“+”;纤维组织增生向肝组织小叶内延伸“++”;肝细胞结构紊乱,纤维组织增生,桥接坏死,早期肝坏死为“+++”。

1.4 统计学方法 记数资料比较用Ridit检验,计量资料比较用t或t'检验。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 在实验过程中,空白组大鼠体重自然增加,行动敏捷,食欲正常,皮毛密集而有光泽;模型组大鼠精神萎靡,倦卧少动,或易激惹,皮毛干涩,蓬松少华,食欲欠佳,体重增长缓慢或不增长,易死亡,尤以雌性大鼠明显;蓍草用药预防各组精神、毛色及进食量均好于模型组。实验过程中模型组大鼠死亡2只,秋水仙碱组和蓍草预防高剂量组各死亡1只。死亡原因经解剖分析均为CCl 4中毒死亡。

2.2 大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的变化 模型组大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的含量均有明显升高,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)。蓍草提取物预防组的低、中、高剂量组血清ALT、AST含量均低于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.),中剂量与秋水仙碱组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.3 大鼠慢性肝损伤肝纤维情况 空结果见 表2。

2.4 大鼠肝脏病理变化 空白组肝小叶结构完整,肝细胞无变性、坏死、炎性细胞浸润及纤维增生。模型组多数肝小叶正常结构被破坏,肝细胞索排列紊乱,肝细胞变性坏死明显,表现为脂肪变性和细胞水肿,伴有程度不等、范围不一的肝细胞坏死及炎性细胞浸润,汇管区扩大,有粗细不均的纤维束从汇管区伸出,纤维组织增生,提示造模成功。

秋水仙碱组可见程度不等、范围不一的肝细胞坏死区及变性的肝细胞,以脂肪变性为主,可见少量正常肝细胞。提示秋水仙碱有预防肝纤维化的作用。蓍草各剂量组肝细胞结构基本正常,纤维组织增生明显减轻,脂肪变性,炎性细胞浸润减少(见图1)。

3 讨 论

体内许多组织均含有谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST),其中ALT主要存在于肝细胞内,AST主要存在于心肌,其次为肝脏。当肝细胞有损害时,由于肝细胞坏死,细胞膜通透性增加,这两种酶即可大量渗入血液,而使血中酶活性增高。

所以血清中这两种转氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝细胞损害和坏死的程度。在本实验研究中,模型组大鼠血清ALT、AST的活性均有明显升高,与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.01),提示CCl4引起肝损伤可致血清ALT、AST含量升高,与文献报道一致[3]。

蓍草提取物预防用药和治疗给药各组血清ALT、AST水平均低于模型组(P<0.,P<0.01),其中蓍草提取物预防低、中剂量组均明显优于秋水仙碱组(P<0.01)。提示蓍草提取物可使转氨酶明显下降,肝功能损害明显减轻,疗效较秋水仙碱组为佳,尤以中剂量组疗效显著。

经观察蓍草3个剂量组的肝组织仍发生肝细胞变性、坏死及炎性细胞浸润,但病变程度远较模型组为轻,表明蓍草对CCl4中毒引起的肝细胞损伤具有很好的保护作用,有助于抑制肝损伤而延缓肝纤维化的作用。

提示蓍草较秋水仙碱具有更好的肝脏保护和抗炎作用,对肝纤维化的防治起积极作用。因此保护肝细胞,减轻肝细胞变性坏死,清除肝纤维化的诱发因素可能是蓍草提取物抗肝纤维化的作用机制之一。秋水仙碱是从百合科植物秋水仙或我国丽江山茨菇中提取的一种生物碱,是较早应用于抗肝纤维化的药物,国外实验证明,秋水仙碱在体外可抑制胶原的合成、分泌或延缓胶原纤维沉 积[4]。

在肝纤维化实验研究中常被用作阳性对照药物。因此本课题采用秋水仙碱作为阳性对照组的药物,并参考采用姜氏等在实验中的使用剂量0.2 mg/kg[5]。

肝纤维化是慢性肝病患者肝脏最重要的组织学改变,是演变成肝硬变的必经之途,其肝纤维化程度决定了肝病预后。近年来的研究表明,肝纤维化的病理是可逆的[6]。只要在肝纤维化阶段而非延误至中晚期肝硬变,进行合理治疗是完全可以达到逆转肝纤维化进程,进而缓解乃至治愈肝纤维化的目的。但

由于肝纤维化的复杂、顽固性,需长期用药,故研制高效无明显毒副作用的抗肝纤维化药物已成为研究的热点之一。近年来,国内外学者对肝纤维化的发生机制,调节因素等方面进行了大量卓有成效的研究,但在阻断肝纤维化上仍缺乏有效措施。

而中医药在逆转肝纤维化及改善临床症状上体现出了较大的潜力和优势。蓍草是一年生草本植物,生产周期短,种植方便,产量高。蓍草预防肝纤维化作用的发现为寻找新的预防肝纤维化药物提供了有利的实验依据,有必要对其有效成分和作用机制开展进一步的研究。

  • 常占杰

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